微课干货│多重PCR技术在NGS领域中的应用

时间:2019-04-10 16:45:38 来源:华大基因学院 浏览数:755



背景回顾


多重PCR作为一种快速构建靶向测序文库的方法,其自身具备的简单、快速、高分辨率、高通量等特点,在基因检测及研究领域发挥越来越大的作用。


上期微课,我们邀请到了华大智造定制化产品平台研发负责人杨林老师,为大家讲解《多重PCR技术在NGS领域中的应用》。本期微课备受欢迎,近2000名童鞋参加了课程。

因课程涉及到的内容较前沿,学员们关注的问题也较多,加之时间有限,课程结束后仍有学员进行提问,根据大家的反馈,我们先将本期微课PPT分析给大家,再将问题整理如下FAQ,供大家参考讨论。

微课PPT分享

多重PCR在NGS领域中的应用

提取码:usir

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01

Q

华大智造的Quick-seq平台怎么做到不用提取DNA就能实现序列的扩增,FFPE样本也可以吗?可以简单描述一下Quick-seq的主要步骤吗?

A:多重PCR体系能够兼容复杂的扩增体系,可以直接用裂解产物就可以进行多重PCR;FFPE样本也可以;Quick-seq主要步骤:先裂解样本15分钟,然后取适量样本进行第一轮特异性PCR(30-60min),纯化(30min),再进行一轮通用PCR(30-60min),最后纯化(30min),得到上机文库;

Quick-Seq在MGI测序平台上的工作流程:

02

Q

请问老师, 如果使用Taq酶做的多重,Error会比较高。 那么在司法的个体识别和无创亲子鉴定中,会不会有问题?

A:Taq 酶的错误率 大约2.7x10-4,高通量测序的错误率大概是3-5x10-3,Taq酶的错误率比高通量测序低一个数量级,因此对于普通的检测需求,Taq酶的错误率其实不会太影响高通量的测序结果。对于司法个体识别和无创亲子鉴定,不需要100%的SNP位点都检测准确,只要保证错误率在一定的范围内就可以。

03

Q

请问老师,针对法医上试剂盒您说不进行DNA提取是针对什么样的样本呢?血液、唾液还是其他样本都可以?

A:多种样本都可以不进行DNA提取,包括血液、唾液、组织、血片、头发、精液、FFPE、骨头、尿液、表面擦拭物等。

04

Q

多重PCR中有脱扣(ADO)现象吗?有的话比例有多少?

A:多重PCR会出现ADO的现象,主要的原因有:a. 模板的投入量,b.引物设计位置上存在SNP,c. PCR扩增的bias;对于普通的多重PCR,当投入的拷贝数大于100个时,这种ADO出现的概率是很小的,而对于单细胞的多重PCR,这个ADO的概率大概是30-80%。

05

Q

在病原微生物方面主要有哪些应用?可以详细介绍一下吗?华大智造有针对食物中毒样本快速应急检测的多重PCR试剂盒吗?感觉不用提取核酸直接PCR很适合疾控系统应对突发卫生事件的快速检测。

A:Quick-seq平台可以定制化设计科研和临床检测方面的应用,科研主要是针对16S和ITS宏基因组,临床方面就是特定病源微生物的检测,目前没有现成的标准化试剂盒,我们可以提供定制化的产品服务,可以在1-2个月内完成产品的交付。

Quick-Seq的定制化周期::

06

Q

探针捕获和多重PCR的比较,各有什么优势,适合什么场景?

A:探针捕获技术适合区域大于1M的panel,而多重PCR适合区域小于1M的panel;探针捕获实验操作复杂,周期长,而多重PCR操作简单,周期短;探针捕获要求的起始量高(>200ng),而多重PCR要求起始量低(>1ng);多重PCR适合目标明确,区域不大的应用,如靶向用药,而探针捕获适合大范围的寻找可能的致病源,如罕见病检测;对于临床来讲,多重PCR技术在实验操作和周期上更适合医院的落地。

07

Q

可以介绍一下Quick-seq平台怎么做Methyl-DNA捕获吗?

A:甲基化目标区域测序是通过多重PCR对重亚硫酸盐处理后的模板进行捕获的,这个多重PCR技术比较特殊,其最大的特点是有效抑制了不同引物对之间的引物二聚体并且大幅度提高了引物的特异性。

08

Q

请问老师:NGS可以同时检测一个基因的融合,扩增,突变么?

A:可以的。对于基因的融合,一般是在RNA水平上进行检测,而扩增和点突变等是基于DNA水平上检测的。一般情况下融合和扩增、点突变需要分别根据RNA和DNA建两个靶向文库,然后在混合在一起进行测序,而我们针对肿瘤开发的热点突变试剂盒可以一次建库中完成RNA和DNA两种靶向文库的制备。

09

Q

不同样本类型多重扩增的效率差异大么,相同的PCR反应体系,分别用不同的DNA聚合酶,引物二聚体形成的量不同。这一现象怎么解释呢?

A:不同来源样本采用相同试剂盒抽提好的DNA进行PCR,其多重PCR扩增的效率差别很小,如果是采用样本直接扩增,其多重PCR扩增效率差别会很大; DNA模板、引物和DNA酶形成起始复合物才能触发DNA的延伸,不同酶对相同模板和引物的形成起始复合物的效率是有差异的,这种差异一般是由于酶中和引物与模板结合的结构域差异导致,而不同的酶这种结构域的结构是有差异的,因此会出现使用不同的聚合酶导致生成引物二聚体的量不一样。

10

Q

请问起始送样量和SNP位点数有要求吗,华大智造的定制化产品平台针对的客户有哪些?

A:我们不做服务,而是提供靶向测序模块化的产品和整体解决方案。华大智造致力于打造行业领先的核心测序平台,针对于靶向测序有一个定制化产品平台:联合多个公司,采用多种技术,针对不同的应用方向,提供多种靶向测序方案。技术平台覆盖DNA、RNA和甲基化,提供从产品设计、实验操作、测序、分析到报告的整体解决方案。目标客户是医检所、提供基因检测服务的公司、科研院所等。

华大智造简介

作为全球领先的基因组学研发机构 华大集团(BGI)旗下子公司,华大智造(MGI)【点击了解】是国内唯一 一家基因测序仪生产商。

秉承着“基因科技造福人类”的理念,华大智造集基因测序仪、配套试剂及耗材等一系列相关产品研发、生产、销售为一体,致力于打造行业领先的核心测序平台,推进基因产业及生命科技的蓬勃发展,为解决实际民生需求提供最前沿的技术保障和解决方案。

与此同时,华大智造业务覆盖生命科学全领域,逐步实现测序技术与B超、质谱、X光、核磁共振、CT等模块的智能化整合,建立针对出生缺陷、肿瘤、感染等疾病防控的贯穿体系,提供实时、全景、全生命周期的生命数字化全套设备,为精准医疗、精准农业等关系国计民生的实际需求提供先进设备和技术保障。